PCR實(shí)驗(yàn)到底需要哪些種類(lèi)的酶
更新時(shí)間：2023-04-03 瀏覽次數(shù)：2164
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的核苷酸片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊核苷酸復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的核苷酸進(jìn)行大幅擴(kuò)增，從而達(dá)到容易鑒定和識(shí)別程度。
各種PCR到底需要哪些種類(lèi)的酶？下面一起跟著遠(yuǎn)慕生物來(lái)了解一下。
DND聚合酶——又稱(chēng)DNA依賴(lài)的DNA聚合酶
它是以DNA為模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一類(lèi)酶。DNA聚合酶根據(jù)聚合酶活力特征和外切酶活性特征的不同，有可以分為多種。在IVD領(lǐng)域中比較常見(jiàn)的酶如下：
Taq DNA聚合酶——Taq DNA聚合酶是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，分子量65kD，
從Thermus aquaticus中分離出來(lái)，是目前科研和分子診斷試劑盒里最為廣泛應(yīng)用的聚合酶。為了更優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，Taq DNA 聚合酶被進(jìn)行了一系列的性能提升和優(yōu)化，其中最為熟知的就是熱啟動(dòng)Taq酶，該酶被進(jìn)行了化學(xué)修飾、抗體修飾或者配體修飾。無(wú)論是哪種修飾，其原理都是：在反應(yīng)體系加熱至高溫之前，Taq DNA 聚合酶活性被“修飾"抑制，進(jìn)而抑制低溫條件下的非特異性擴(kuò)增。另外，還有一系列突變體Taq DNA聚合酶被篩選出來(lái)以滿(mǎn)足耐鎂離子、耐鹽、高保真等要求。
Bst鏈置換DNA聚合酶——Bst DNA聚合酶是來(lái)源于 Bacillus stearothermophilus的DNA Polymerase I，經(jīng)基因工程改造去除了其 5’-3’核酸外切酶活性，但保留了 5’-3’ DNA 聚合酶活性和強(qiáng)鏈置換活性。同時(shí)，該酶在擴(kuò)增速度、產(chǎn)量、耐鹽性和熱穩(wěn)定性等方面均有大幅提高，而且增加了dUTP耐受性，非常適合于防污染的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，如 LAMP 等。
由于此次新冠的影響，Bst成為IVD領(lǐng)域內(nèi)又一個(gè)DNA聚合酶寵兒。
Tth DNA聚合酶——Tth DNA聚合酶來(lái)自Thermus thermophilus HB8，其最有趣的現(xiàn)象是：在Mg2+條件下，Tth DNA聚合酶具有較強(qiáng)的DNA聚合酶活性。在Mn2+條件下，Tth DNA聚合酶具有更強(qiáng)的反轉(zhuǎn)錄活性。這一特性使得Tth DNA聚合酶搭配相應(yīng)的buffer可以同時(shí)對(duì)DNA模板和RNA模板進(jìn)行擴(kuò)增。
逆轉(zhuǎn)錄酶——又稱(chēng)為RNA依賴(lài)的DNA 聚合酶
該酶以RNA為模板，按5'-3'方向合成一條與RNA模板互補(bǔ)的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補(bǔ)DNA (complementary DNA，CDNA)。最chang用的逆轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV和AMV。
RNA聚合酶——一條DNA鏈或RNA為模板的聚合酶
也稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄酶。最為常見(jiàn)的是T7 RNA聚合酶，分子量約99kDa。專(zhuān)門(mén)催化5'→3'方向的RNA形成過(guò)程。目前體外診斷中， SAT技術(shù)中會(huì)看到RNA 聚合酶的身影。
實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（Simultaneous Amplification and Testing，簡(jiǎn)稱(chēng)SAT）是將新一代的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的一種新型核酸檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)具有高靈敏度、高特異性、低污染、反應(yīng)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。同一溫度下，首先通過(guò)M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生靶標(biāo)核酸（RNA）的一個(gè)雙鏈DNA拷貝，然后利用T7 RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)（100～1000個(gè)）RNA拷貝；每一個(gè)RNA拷貝再?gòu)姆崔D(zhuǎn)錄開(kāi)始進(jìn)入下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；同時(shí)，帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號(hào)可由熒光檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)捕獲，實(shí)時(shí)反映擴(kuò)增循環(huán)情況。
蛋白酶K——能夠酶解樣本中的各類(lèi)蛋白質(zhì)的酶
蛋白酶K是一種從白色念珠菌分離出來(lái)的強(qiáng)力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，在較廣的pH范圍（4?12.5)內(nèi)及高溫 (50?70°C)下均有活性，EDTA等螯合劑或SDS等去垢劑均不能使之失活。用于質(zhì)粒或基因組DNA、RNA的分離和抽提。在病毒核酸檢測(cè)中，蛋白酶K是病毒采樣液中的重要組分之一，蛋白酶K可以裂解病毒的外殼蛋白并使其失活，同時(shí)將病毒基因組釋放以便后續(xù)進(jìn)行核酸抽提。
當(dāng)然，除了以上提及的酶以外，還有其他各種各樣的酶被廣泛應(yīng)用。